下调STAT3基因对食管癌细胞TE1凋亡的影响

【摘要】食管癌作为一种消化系统恶性肿瘤，严重威胁人们身体健康、影响生活质量。据流行病学调查显示，我国是全球食管癌的高发地带，每年因食管癌死亡人数达15万余人，位居世界食管癌死亡人数的第一位。食管癌的发生与饮食习惯、致癌物质、疾病、遗传、环境等因素都密切相关。目前，治疗食管癌的临床方法主要有手术疗法、放射疗法、化疗药物疗法、包括内镜疗法在内的非手术疗法等。但食管癌早期诊断困难，且恶性程度高，一经诊断，已至晚期，所以目前食管癌的治疗效果和预后仍然很差，5年生存率仍低于30%。随着分子生物学在肿瘤病因学研究方面的发展，人们对食管癌的发病原因逐步有了新的认识。目前普遍认为食管癌的发生涉及多种因素，多种基因，并且在多阶段发挥作用,利用在分子生物手段对其早期诊断、治疗及预防具有重要意义。研究发现STAT3在食管鳞癌细胞中高表达，本实验以其为靶点，探讨下调STAT3基因表达诱导食管鳞癌细胞TE1凋亡的分子机制。实验目的：（1）本实验选用针对STAT3的长效RNA干扰质粒psilencer-shRNA-stat3，通过脂质体转染食管鳞癌细胞TE1，以期达到沉默STAT3基因表达的效果。（2）探讨下调STAT3基因表达，抑制食管癌TE1细胞增殖、诱导细胞凋亡的分子机制。实验方法：选用针对人STAT3mRNA序列设计的质粒psilencer-shRNA-stat3和阴性对照质粒psilencer-shRNA-scramble通过脂质体2000转染食管鳞癌细胞TE1。免疫印迹分析转染后TE1细胞STAT3蛋白，细胞周期蛋白CyclinB1，癌蛋白C-myc，抑癌蛋白P53，抗凋亡蛋白Bcl-2，凋亡相关蛋白Caspase-3（32KDa，17KDa）表达水平。流式细胞仪分析转染后TE1细胞周期分布。提取转染后TE1细胞基因组DNA电泳分析细胞凋亡。荧光显微镜观察转染后TE1细胞线粒体膜电位变化。Annexin-V-FLOUS试剂盒处理转染后TE1细胞，流式细胞仪分析细胞凋亡率。TUNEL法检测转染后TE1细胞的凋亡。实验结果：（1）蛋白免疫印迹分析结果证实，shRNA-stat3组（转染psilencer-shRNA-stat3质粒组）TE1细胞中STAT3蛋白表达水平显著低于shRNA-scramble组（转染psilencer-shRNA-scramble质粒组）（p<0.05），提示质粒psilencer-shRNA-stat3表达的stat3-shRNA能够有效抑制STAT3基因表达。（2）流式细胞仪分析转染后TE1细胞周期分布变化。结果显示，shRNA-stat3组细胞S期细胞数显著低于shRNA-scramble组（p<0.05），而G2/M期细胞数则显著高shRNA-scramble组（p<0.05），提示抑制STAT3基因表达引发TE1细胞在增殖过程中发生了G2/M期阻滞。进一步通过免疫印迹法检测细胞G2/M期关键周期蛋白CyclinB1表达水平，结果证实shRNA-stat3组CyclinB1表达水平显著低于shRNA-scramble组（p<0.05），提示下调CyclinB1为TE1细胞产生G2/M期阻滞的原因。（3）光学显微镜观察转染后TE1细胞形态，显示转染后细胞皱缩、变圆、内部颗粒物增多，细胞间连接消失，这是凋亡细胞的典型特征。据此本实验通过多种凋亡检测方法分析转染后TE1细胞的凋亡。DNALadder电泳结果显示shRNA-stat3组的细胞基因组DNA在180~1000bp有较为明显的小片段DNA。荧光显微镜下观察TUNEL凋亡试剂盒处理的转染后TE1细胞结果显示shRNA-stat3组细胞凋亡率20%以上。荧光显微镜下观察转染后TE1细胞线粒体膜电位变化显示，shRNA-stat3组凋亡细胞比例约为30%，而shRNA-scramble组和control组凋亡细胞数目可以忽略不计。用流式细胞仪分析Annexin-V-FLOUS试剂盒处理的转染后24h和48hTE1细胞，凋亡率分别为29.06%和43.32%（p<0.05），显著高于shRNA-scramble组。与膜电位检测和TUNEL法检测的细胞凋亡率相一致。（4）为进一步在分子水平上探讨TE1细胞的凋亡机制，通过免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白表达水平，结果显示shRNA-stat3组细胞凋亡蛋白酶原型Caspase-3（32KDa）表达水平显著低于shRNA-scramble组（p<0.05），而凋亡蛋白活化型Caspase-3（17KDa）表达量显著高于shRNA-scramble组（p<0.05），二者是细胞凋亡的执行者，是细胞发生凋亡的直接标志分子。另外原癌蛋白C-myc表达量下调，抑制了TE1细胞增殖。同时抑癌蛋白P53表达上调，抗凋蛋白Bcl-2表达下调，有研究表明二者协同作用，可诱导细胞凋亡。实验结论：（1）转染psilencer-shRNA-stat3质粒能够有效地下调TE1细胞STAT3基因表达。（2）下调STAT3基因表达，抑制了细胞周期蛋白CyclinB1的表达，引起食管鳞癌细胞TE1发生了G2/M期阻滞。（3）下调STAT3基因表达，引起抑癌蛋白P53表达上调，抗凋蛋白Bcl-2表达下调，连同原癌基因蛋白产物C-myc下调和细胞周期蛋白CyclinB1下调共同激活Caspase-3通过经典细胞内凋亡途径—线粒体途径，诱导TE1细胞凋亡。
【作者】邵丹；
【导师】焦平；
【作者基本信息】吉林大学，生物医学工程，2014，硕士
【关键词】食管癌细胞TE1；STAT3；RNA干扰；细胞凋亡；

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